樣品稀釋劑在HILIC中的重要性

引言

當使用親水相互作用液相色譜法（HILIC）時，樣品稀釋劑的選擇對峰形有顯著的影響。稀釋劑的錯誤選擇可能會導致色譜峰形差，峰分裂和保留時間的不穩(wěn)定。

這張ACE知識卡片探討了在HILIC方法開發(fā)過程中如何確定合適的稀釋劑。

樣品稀釋劑與峰形

理想情況下，HILIC模式下樣品的稀釋劑應該盡可能的接近分離化合物的流動相組成，即稀釋劑由高比例的弱溶劑組成，如乙腈。對HILIC模式下梯度洗脫，樣品稀釋劑應該類似梯度方法流動相的起始條件。在某些情況下，可能會出現(xiàn)這種情況，極性化合物的樣品溶解度問題：在HILIC中可能會遇到分析物相對不溶于高濃度的有機溶劑。

有時候，遇到HILIC峰形問題可以通過樣品稀釋劑的選擇來解決。樣品溶解在含高水稀釋劑中是否為問題源頭，因為水是強溶劑，洗脫能力強。樣品被大量水包圍，破壞了化合物分配到HILIC固定相表面富水層的機制。這就導致了化合物較差的峰形和保留時間的不穩(wěn)定，尤其是保留較弱的化合物。圖1 顯示了2-脫氧尿苷分別用流動相和水做稀釋劑獲得的峰形圖。當被分析物溶解在水里，觀察到峰寬很大，幾乎裂開的峰。通過用流動相來改變樣品的稀釋液，峰的形狀和信號強度得到顯著的改善。

HILIC色譜法，樣品的稀釋劑選擇視具體應用而定，因此在方法開發(fā)中，應分配資源研究樣品稀釋劑的影響，通常是稀釋劑的作用強度影響可能依賴于分析物，還受固定相和洗脫液的條件的影響。因此建議進行分步調(diào)查來探究提高有機溶劑的比例對于峰形和方法的影響。在50 - 90%乙腈中以增加10%的乙腈量增加：緩沖液可以幫助理解如何實現(xiàn)目標分析物的最佳峰形。

圖1.樣品稀釋劑對于2-脫氧尿苷峰形的影響

色譜柱：ACE 5 HILIC-N, 150 x4.6mm.流速：1.5mL/min。流動相：10 mM 甲酸銨 pH4.7 in乙腈：水=9：1。進樣量：5uL.。溫度：25℃。 檢測器：UV，254nm。

圖2顯示了在流動相pH 3.0 條件下，堿性、酸性和中性分析物的樣品稀釋劑對于三個ACE HILIC固定相（ACE HILIC-A、ACE HILIC-B、ACE HILIC-N）的影響的研究結(jié)果。樣品稀釋劑為乙腈和水的混合溶液，水的百分率介于0-100%之間。

次黃嘌呤（極性中性）的峰形一般隨著乙腈濃度的增加而改善，最佳的有機溶劑含量在60-80%左右。酪胺(堿性)在低百分比有機相稀釋劑條件下，HILIC-B和HILIC-N上出現(xiàn)分裂峰， HILIC-A峰形很差。當乙腈的濃度大于60%，峰形得到顯著的改善。扁桃酸的峰形在HILIC-B和HILIC-N相上受稀釋劑的影響較小，而對于HILIC-A相，在高水濃度下峰形較差。總的來說，從這個數(shù)據(jù)集合來看，對于這個應用，樣品推薦使用由60-80%有機相組成的稀釋劑。

圖2：次黃嘌呤、酪胺和扁桃酸在（a）ACE 5 HILIC-N、（b）ACE 5 HILIC-A、（c）ACE 5 HILIC-B，150 x 4.6mm。在乙腈：水（90：10 v/v）甲酸銨調(diào)溶液pH 3.0。流速：1.5mL/min。溫度：25℃。檢測器：UV，254nm。進樣量：5uL。

結(jié)論：

樣品稀釋劑的選擇對峰形和方法有重要影響。一般來說，就是樣本稀釋劑應由盡可能高比例的較弱的流動相溶劑(HILIC模式中通常是乙腈)組成。應盡可能避免使用含高比例水的樣品稀釋劑。對于一個給定的應用，一個系統(tǒng)的樣品稀釋劑評估，可以幫助消除任何不良峰形的影響。