做方法開發(fā)的小伙伴們經(jīng)常會遇到這樣的情況，我們拿到一個樣品后，得知了樣品的部分屬性，但是在選擇色譜柱上面卻無從下手。
因為色譜柱的種類千差萬別，在USP（美國藥典）中色譜柱分類從L1-L46，竟然有這么多，我究竟該選擇哪一種色譜柱才更適合我呢？
色譜柱種類很多，而且每個廠家的色譜柱也不一樣，有時候同樣是C18的色譜柱，不同廠家的色譜柱之間也會有差別，我們要想選擇合適的色譜柱，就需要對色譜柱的分類和內(nèi)在性質(zhì)有所了解
液相色譜柱常用的分類方法為按照用途劃分，可以分為以下幾類：
1. 反相柱RP（C18、C8、C4/C3）
2. 正相柱NP
3. 尺寸排阻柱（SEC）
4. 離子交換柱（IEX）
5. 親水相互作用柱（HILIC）
我們下面針對這幾種色譜柱逐一進(jìn)行講解：
一、反相柱（RP，Reversed Phase）
反相柱是實驗室使用廣泛的色譜柱，它是以硅膠填料為基礎(chǔ)，中間鍵合了極性相對較弱的官能團(tuán)鍵合相，流動相一般為極性較強(qiáng)的有機(jī)相（甲醇、乙腈）。
溶質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，所以先被洗脫下來。
而極性較小疏水性較大的物質(zhì)，就被保留下來，隨著有機(jī)相比例增大，被依次洗脫下來。
反相柱也有很多亞類，按照碳鏈的長短可以分為C18、C8、C4/C3。我們常說的ODS就是C18色譜柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅膠填料），這種色譜柱常用來分析化學(xué)小分子物質(zhì)，在生物制藥領(lǐng)域多用來進(jìn)行氨基酸分析、多肽分析（<10KD），肽圖分析等。
使用C18色譜柱需要注意的是，C18色譜柱能夠耐受的pH值一般在3-8之間， 過低或者過高的pH值都會損壞色譜柱，造成硅膠溶解。
有些C18色譜柱能夠耐受的pH低至1，這些色譜柱往往是在C18硅膠填料的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾形成的，值得一提的是Waters的BEH（亞乙級橋雜化技術(shù)），高pH條件下柱穩(wěn)定性的強(qiáng)化測試結(jié)果表明柱壽命比超純硅膠柱提高十倍以上，能夠顯著提高色譜柱的酸堿耐受性。
此外，高鹽溶液（>0.5M）也容易造成一定的硅膠填料溶解，所以鹽溶液在分析過程中盡量要控制濃度，而且在與有機(jī)相進(jìn)行混合的時候，比例要緩慢改變，否則容易造成鹽的沉淀堵塞色譜柱。
上述pH與高鹽溶液都是對色譜柱具有不可逆破壞的物質(zhì)，此外還有一些物質(zhì)也會對色譜柱造成影響，但是可以經(jīng)過一定的方法進(jìn)行清洗再生。
一些添加劑會造成峰型改變，例如SDS、吐溫、Triton等，可能造成柱壓升高，需要多沖沖柱子才能解決。
此外，C18的色譜柱也盡量不要使用純水相，否則可能造成疏水塌陷，影響色譜柱的保留特性。
如果出現(xiàn)疏水塌陷，需要使用高比例有機(jī)相過夜沖洗，可以進(jìn)行恢復(fù)。
C8和C4（有的廠家會出C3）色譜柱一般是針對大蛋白或者單抗的，碳鏈越短，對分子量較大的蛋白分析越有利。單抗一般選擇C4色譜柱，抗原或者單抗亞基（LC&HC）可以選擇C8色譜柱進(jìn)行分析。值得一提的是分子量較大的蛋白在反相柱上都會有一定的殘留，這時候我們需要采取一定的措施較少殘留，不讓殘留在下一樣品上形成鬼峰。一般采取的措施是每個樣品之間走一個空白，并且提高色譜柱的柱溫至70-80℃。流動相的pH對樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響也很大，進(jìn)而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對物質(zhì)，常用的離子對試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1%，使流動相的pH值為2～3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離解，使其疏水性增加，延長洗脫時間，提高分辨率和分離效果。
除此之外，還可以嘗試磷酸、醋酸、甲酸。
二、正相柱（NP，Normal Phase）
正相柱與反相柱相似，也是以硅膠填料為基礎(chǔ)，但是正相柱上鍵合的是極性相對較強(qiáng)的官能團(tuán)鍵合相（如帶有二醇基、氨基、和氰基的固定相及硅膠、三氧化二鋁等），流動相一般為極性較弱的正己烷等物質(zhì)。簡單來說，如果采用固定相的極性大于流動相的極性，就稱為正相色譜；如果固定相的極性小于流動相的極性，則稱為反相色譜。
正相色譜一般用來分離中性化合物和離子化合物，主要以中性樣品為主。正相色譜分析的樣品有以下幾種：異構(gòu)體、族類分離、易水解樣品、高脂溶性樣品。我們所知的氨基柱和氰基柱（官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基）在正相色譜上使用都很多。
三、尺寸排阻柱（SEC，Size Exclusion Column）
尺寸排阻色譜柱（SEC）是根據(jù)蛋白的分子量大小進(jìn)行分離的一種色譜柱，采用的是多孔硅膠填料，分子量小的物質(zhì)能夠進(jìn)入到硅膠孔內(nèi)，走的路程多，分子量大的物質(zhì)被排阻在硅膠孔外，走的路程少。于是分子量大的物質(zhì)就先流出，分子量小的物質(zhì)后流出，通過這種方法就可以將蛋白分離開了。
SEC色譜柱主要用于分析蛋白的聚集體狀態(tài)，在生物制藥領(lǐng)域蛋白質(zhì)聚集體是需要嚴(yán)格控制的一個檢項，因為聚集體很可能會產(chǎn)生免疫原性，造成藥物的過敏反應(yīng)。SEC可以很好的針對單抗，抗原等物質(zhì)進(jìn)行分析，分離出降解片段，單體，二聚體及多聚體。SEC色譜柱也有很多亞類，根據(jù)填料的孔徑大小分類，可以分為1000A，300A和150A等幾類。300A孔徑的色譜柱經(jīng)常用來分析單抗以及雙特異性抗體，這類色譜柱的分離范圍在30kd-200kd之間。1000A的色譜柱填料孔徑較大，適合分離大于200kd的大蛋白，以及一些ADC藥物。而150A的色譜柱填料孔徑較小，適合分離抗原或者多肽類藥物，它的分離范圍在5kd-60kd之間。所以我們可以根據(jù)樣品的分子量大小選擇合適的色譜柱進(jìn)行分離，值得一提的是SEC色譜柱基于它的特殊填料處理方式，似的硅膠顆粒基本不與蛋白發(fā)生相互作用，所以SEC色譜柱分離大蛋白不會產(chǎn)生蛋白殘留，是一種理想的單抗分離手段。
SEC色譜柱一般使用緩沖鹽作為流動相，常用的是PBS（磷酸鹽緩沖液），相對于其他種類色譜柱，SEC色譜柱的壽命是比較短的。在SEC色譜柱使用久了以后會產(chǎn)生拖尾，或者峰展寬的情況，這時候我們可以對SEC色譜柱進(jìn)行再生清洗。一般再生的方法有幾種，可以根據(jù)需要結(jié)合起來使用：
1. 10%-20%甲醇低流速（正常流速的30%）沖洗15-20個CV（柱體積，column volume）
2. 0.25M Na2SO4或者NaCl沖洗5CV，純水沖洗5CV，交替沖洗2次。
3. 5%異丙醇（IPA）沖洗5CV，沖洗過程中可以滿環(huán)進(jìn)樣6M鹽酸胍或者8M尿素，確保色譜柱上殘留蛋白的變性。
以上方法沖洗可以對色譜柱進(jìn)行再生，如果效果不是太好，可以嘗試進(jìn)行反沖，但是對于亞2微米的色譜柱，不可以進(jìn)行反沖，否則填料就會流失。如果進(jìn)行了反沖，建議以后色譜柱反著使用，因為反沖后的色譜柱整體結(jié)構(gòu)有一定損壞，雖然暫時性能提升了，但是柱效的下降要比新柱子快很多，所以反沖盡量要慎重選擇。
有時候峰型變差可能是由于蛋白引起的，我們換一個樣品之后就好了，這是因為SEC色譜柱雖然是消除了蛋白與色譜柱的相互作用，但是現(xiàn)有技術(shù)無法做到100%消除這種作用，對于某些蛋白仍然是會有一定相互作用的。這時候我們在分析過程中可以添加精氨酸或者2%的IPA，或者加入150mM NaCl去減弱這種相互作用，可以改善峰型。
如果上述方法都沒有效果，那么我們可能需要更換一根新的色譜柱了。在以后的分析過程中，我們可以增加一根保護(hù)柱（guard column）或者加上在線濾器（online filter），都可以有效延長SEC色譜柱的壽命。
四、離子交換柱（IEX，ion exchange）
離子交換色譜柱在硅膠基質(zhì)的固定相上鍵合SO3-、COO-、NH3+等離子官能團(tuán)，使固定相帶上電荷。這種電荷與流動相中相反電荷的離子中和。當(dāng)樣品帶有與固定相相反的電荷時，就被固定相抓取，隨著流動相中相反電荷增加，與樣品競爭性的和固定相結(jié)合，這樣就把樣品從固定相上取代下來，流出色譜柱。
離子交換柱按固定相電荷種類不同可以分為陽離子交換柱（CEX），陰離子交換柱（AEX）。其中陽離子交換柱固定相上鍵合陰離子基團(tuán)，又分為強(qiáng)陽離子交換柱（SCX）和弱陽離子交換柱（WCX）；陰離子交換柱固定相上鍵合陽離子基團(tuán)，又分為強(qiáng)陰離子交換柱（SAX）和弱陰離子交換柱（WAX）。生物制藥領(lǐng)域多使用弱陽離子交換柱（WCX），這是因為生物制藥針對大蛋白，且蛋白的等電點一般在中性左右，故使用比蛋白等電點低1個單位的WCX更加合適。
WCX色譜柱主要用來進(jìn)行電荷異構(gòu)體的分析，根據(jù)不同的電荷異質(zhì)性，我們可以得到相關(guān)的酸性峰，主峰和兩個堿性峰。再結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，我們可以發(fā)現(xiàn)2個堿性峰是單抗的末端賴氨酸（Lys）引起的，主峰是缺失兩個Lys形成的，酸性峰是脫酰胺造成的。
WCX方法的優(yōu)化可以使用鹽梯度進(jìn)行，也可以使用pH梯度進(jìn)行，每家的儀器都有相關(guān)的離子交換方法開發(fā)軟件，方便我們對離子交換的溶液配制以及梯度調(diào)整，這里不再一一說明。
五、親水相互作用柱（HILIC，Hydrophilic Interaction column）
HILIC色譜柱是以硅膠基質(zhì)，鍵合強(qiáng)親水性的極性官能團(tuán)，利用水相和有機(jī)相作為流動相的一類色譜柱。HILIC色譜柱的使用方式和反相RP色譜柱正好相反，初始是較高的有機(jī)相，然后不斷的增加水相比例，將極性較強(qiáng)的物質(zhì)依次洗脫下來。
HILIC色譜柱在生物制藥領(lǐng)域主要用于糖基化（Glycosylation）的分析。糖基化是真核細(xì)胞（酵母、CHO）蛋白翻譯后修飾（PTM）的重要方式，糖基化的差異可能直接導(dǎo)致細(xì)胞的ADCC（抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）、CDC（補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用），以及一些免疫過敏反應(yīng)（非人源化唾液酸NGNA），所以HILIC色譜柱進(jìn)行糖基化檢測被廣泛應(yīng)用在生物制藥領(lǐng)域。
常見的色譜柱就是這些啦，在生物制藥領(lǐng)域主要使用RP、SEC、IEX、HILIC這幾種色譜柱，大家把這幾種色譜柱的主要使用環(huán)境牢記于心，在方法開發(fā)的時候就能夠游刃有余，選擇出適合自己分析的色譜柱了。
